بررسی توکسین زایی توکسین آلفا کلستریدیوم پرفرنجنس جداشده از نشخوارکنندگان کوچک استان کرمان
چکیده
کلستریدیوم پرفرنجنس باکتری میله ای گرم مثبت، اسپورزا، و بی هوازی است که باعث بیماری و مرگ و میر در انسان و دام می شود. چهار توکسین اصلی آلفا، بتا، اپسیلون و یوتا برای استفاده در طبقه بندی کلستریدیوم پرفرنجنس به تیپ های A، B، C، D و E کاربرد دارد. یکی از این توکسینها که در همه تیپها مشترک می باشد، توکسین آلفا است. بررسی میزان توکسین زایی این باکتری می تواند معیار سنجش مناسبی برای بیماریزایی باشد. بدین منظور میزان کشندگی توکسین آلفا مترشحه از کلستریدیوم پرفرنجنس تیپ A هدف این تحقیق می باشد. از سویه های کلستریدیوم پرفرنجنس تیپ A جداشده از نشخوارکنندگان کوچک استان کرمان بر روی محیط غنی شده کشت داده شد و در شرائط بی هوازی در گرمخانه نگهداری شد. پس از نمونه بردای از سوسپانسیون حاوی باکتری و سانتریفیوژ، رقتهای متفاوت تهیه گردید. آزمون حداقل میزان کشندگی(MLD)[1] با تزریق به حیوان آزمایشگاهی انجام شد. همچنین از محلول رویی رقیق شده با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در دو طول موج متفاوت جهت سنجش پروتئین تام استفاده شد. در تمام مراحل سوش استاندارد بعنوان کنترل مثبت در نظر گرفته شد.از آنجائیکه مایع رویی محیط کشت، حاوی توکسین می باشد رقتهای تهیه شده باعث تلف شدن موش ها گردید. میانگین میزان حداقل میزان کشندگی معادل 16/34 بدست آمد و فقط در دو نمونه حداقل میزان کشندگی در حد نمونه کنترل بود. میانگین میزان پروتئین تام بدست آمده نمونه ها در حد سوش استاندارد برابر بود. یـکـی از خصوصیات کلستریدیوم پرفرنجنس ترشح توکسین بـه درون محیط کشت می باشد. توکسین آلفا با توجه به ساختار پروتئینی باعث تخریب لایه های سلولی و نهایتا“ مرگ می گردد. پس از مقایسه نتایج حداقل میزان کشندگی و مقادیر پروتئین تام این نتیجه گرفته شد که می توان از تعدادی از باکتریهای کلستریدیوم پرفرنجنس تیپ A جدا شده از دستگاه گوارش نشخوار کنندگان کوچک در تحقیقات بعدی استفاده نمود.
کلمات کلیدی:
کلستریدیوم پرفرنجنس. توکسین آلفا، پروتئین تام، حداقل میزان کشندگی(MLD)
Abstract
The Clostridium perfringens (C. perfringens) bacteria are Gram-positive, rod-shaped, spore-forming, and anaerobic bacteria that cause illness and death in humans and animals. Four main groups of C. perfringens toxins include alpha, beta, epsilon and iota, and accordingly classified into five different types A, B, C, D and E. One of these toxins, common in all types, is toxin alpha. Determining the level of toxigenic of this bacterium can be a good measure for the pathogenicity. For this purpose, the amount of toxin alpha released from C. perfringens of type A is aimed at this study. C. perfringens type A strains isolated from small ruminants of Kerman province were cultured on enriched environments and stored in anaerobic conditions in incubation. After the sampling of bacterial and centrifuge suspensions, different dilutions were prepared. Minimum Lethal Dose (MLD) test was injected into the laboratory animal. Also, the diluted supernatant was used by spectrophotometer device in two different wavelengths to measure total protein. In all stages, the standard strain was considered as positive control. The mean MLD was equal to 34.16 and only in two samples: the MLD was within the MLD level of the control sample. The mean total protein obtained with the standard strain was equal. One of the characteristics of C. perfringens is secretion of toxin into the culture medium. Alpha toxin, due to its protein structure, can destroy cell layers and ultimately die. After comparing the results of MLD and total protein values, it was concluded that a number of C. perfringens type A isolated from the digestive tract of small ruminants could be used in subsequent experiments.
Keywords: Clostridium perfringens type A, Toxin, MLD, Total protein.
فهرست مطالب
فهرست مطالب
عنوان صفحه
1-1- ویژگیهای جنس کلستریدیوم 2
1-1-7- ترشح آنزیم هاي خارج سلولي. 4
1- 2- جداسازی و شناسایی کلستریدیوم ها 5
1-2-1- انواع همولیز در محیط کشت.. 6
1-2-4 – هيدروليز لسیتين در محيط آگار زرده تخم مرغ. 7
1-3 – تاریخچه کلستریدیوم پرفرنجنس… 8
عنوان صفحه
1-3-6- توکسینهای اصلی باکتری کلستریدیوم پرفرنجنس… 12
1-4 – بررسی توکسين آلفا کلستریدیوم پرفرنجنس تیپ A. 13
1-4-1- ساختار آنزيمي توکسین. 13
1-4-2- مکانیسم عمل توکسین آلفا 14
1-4-5- فعالیت توکسین آلفا برروی غشا ء سلولی. 18
فصل دوم: سابقه و پيشينه ي تحقيق
2-1- پیشینه تحقیقات انجام شده 23
عنوان صفحه
3-1-3- آزمون هيدروليز لسیتين. 29
3-2-1- محیط کشت پایه کلستریدیوم پرفرنجنس… 30
3-2-2- محیط کشت نوترینت براث حاوی عصاره جگر (محیط ارلن جگر) 31
3-2-3- محیط کشت نوترینت براث حاوی تکه های جگر (محیط لوله 18 سانت) 31
3-4-2- مرحله دوم- پاساژ بذر 32
3-4-3- مرحله سوم- کشت بذر نهائی. 32
3-4-4- مرحله چهارم- آماده سازی توکسین. 33
3-4-5-مرحله پنجم- تهیه رقت ها 33
3-4-6- تزریق به موش و بررسی میزان تلفات.. 33
3-4-7- تعیین میزان پروتئین تام 34
پیوست الف: آزمون آماری T-Test برای بررسی نتایج آزمون MLD. 52
عنوان صفحه
پیوست ب: آزمون آماری T-Test برای بررسی نتایج آزمون سنجش پروتئین تام 52
پیوست ج: آزمون آماری تعیین ضریب همبستگی بین نتایج آزمون های MLD و سنجش پروتئین تام 53
فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل 1-1: پس ازاتصال دامین C توکسین آلفا به غشاء سلولی…. 16
شکل 1-2: ساختار پروتئینی توکسین آلفا 18
شکل 3-2: محیط کشت آگارخونداروانواع همولیز. 28
شکل 3-4: آزمون هیدرولیز لسیتین.. 29
شکل 3-6: واکنش شير ليتموس و پديده تخمير طوفاني.. 30
شکل 3-8: محیط لوله 18 سانت.. 31
شکل 3-9: کشت باکتری از محیط لوله 18 سانت به محیط ارلن جگر. 32
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 1-1: خصوصیات رشد کلستریدیوم پرفرنجنس (ملک زاده و شهامت، 1388) 11
جدول1-2: توکسین وتیپ های کلستریدیوم پرفرنجنس (ملک زاده و شهامت، 1388) 11
جدول ٤-1: میزان MLD براساس تلفات موش ها 36
جدول ٤-٤: میانگین پروتئین تام بدست آمده هر نمونه 38
جدول پیوست 1: آنالیز آماری نتایج آزمون MLD.. 52
جدول پیوست 2: جدول تحلیل آنالیز آماری T-Test نتایج آزمون MLD.. 52
جدول پیوست 3: آنالیز آماری نتایج آزمون سنجش پروتئین تام 52
جدول پیوست 4: جدول تحلیل آنالیز آماری T-Test نتایج آزمون سنجش پروتئین تام 52
جدول پیوست 5: آنالیز آماری ضریب همبستگی بین نتایج آزمون های MLD و سنجش پروتئین تام 53
منابع فارسی
- احسني، م. محمد آبادي، م. شمس الديني بافتي، م. عزتخواه، م. حسني درخشان، م. اسمعيلي زاده كشكوئيه، ع. 1389. كاربرد تكنيك Triplex PCR در شناسايي تيپ هاي B،C و D كلستريديوم پرفرينجنس. فصلنامه پژوهشهای علوم دامی ایران، 2(2)، 189-184.
- پایگاه اینترنتی تبیان به آدرس: http://www.tebyan.net/newindex.aspx/index.aspx?pid=934&articleid=474273
- حسنی طباطبایی، ع.، فیروزی، ر. 1390. بیماریهای باکتریایی دام. تهران: دانشگاه تهران.
- محمدی، م. 1380. نکاتی در باره میکروبیولوژی آزمایشگاهی. تهران: انتشارات جنگل.
- ملک زاده، ف.، شهامت، م. 1388. میکروبیولوژی عمومی. تهران: دانشگاه علوم پزشکی تهران.
- پایان نامه دکترا]. کرمان: دانشکده داروسازی وعلوم دارویی دانشگاه علوم پزشکی کرمان، 1380؛ شماره 437: 10-8.
منابع انگلیسی
- Alape‐Girón, A., Flores‐Díaz, M., Guillouard, I., Naylor, C. E., Titball, R. W., Rucavado, A., Cole, S. T. (2000). Identification of residues critical for toxicity in Clostridium perfringens phospholipase C, the key toxin in gas gangrene. European Journal of Biochemistry, 267(16) 5191-5197.
- Al-Khaldi, S. F., Villanueva, D., & Chizhikov, V. (2004). Identification and characterization of Clostridium perfringens using single target DNA microarray chip. International journal of food microbiology, 91(3), 289-296.
- Ardehali, M., Moosawi, M., & Pilahian, R. (1994). Isolation of Toxigenic Strains of Clostridium perfringens from the soil of farms in Iran. Arch. Inst. Razi, 44(45), 95-100.
- Bartholomew, J., & Mittwer, T. (1991). Cell structure in relation to the Gram reaction as shown during lysis of Bacillus subtilis. Microbiology, 5(1), 39-45.
- Bateman, A., & Sandford, R. (1999). The PLAT domain: a new piece in the PKD1 puzzle. Current biology, 9(16), R588-S582.
- Bentancor, A. B., Rodriguez Fermepín, M., Bentancor, L. D., & de Torres, R. A. (1999). Detection of the etx gene (ε-toxin inducer) in plasmids of high molecular weight in Clostridium perfringens type D. FEMS Immunology & Medical Microbiology, 24(3), 373-377.
- Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria.
- Bokori‐Brown, M., Savva, C. G., Fernandes da Costa, S. P., Naylor, C. E., Basak, A. K., & Titball, R. W. (2011). Molecular basis of toxicity of Clostridium perfringens epsilon toxin. The FEBS journal, 278(23), 4589-601.
- Buxton, D. (1978). In-vitro effects of Clostridium welchii type-D epsilon toxin on guinea-pig, mouse, rabbit and sheep cells. Journal of medical microbiology, 11(3), 299-302.
- Cato, E. (1986). Genus Clostridium Prazmowski 1880, 23^< AL. Bergey’s manual of systematic bacteriology, 2, 1141-1200.
- Dunlop, P. S., McMurray, T. A., Hamilton, J. W., & Byrne, J. A. (2008). Photocatalytic inactivation of Clostridium perfringens spores on TiO 2 electrodes. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, 196(1), 113-119.
- El Shorbagy, M., Lamyaaand, M., & Mona, H. (2012). Prevalence of Clostridium perfringens Alpha toxin in processed and unprocessed fish. Int. J. of Microbiol. Res, 3(3), 195-199.
- Fernandez-Miyakawa, M. E., Jost, B. H., Billington, S. J., & Uzal, F. A. (2008). Lethal effects of Clostridium perfringens epsilon toxin are potentiated by alpha and perfringolysin-O toxins in a mouse model. Veterinary microbiology, 127(3), 379-385.
- Fernandez-Miyakawa, M. E., Marcellino, R., & Uzal, F. A. (2007). Clostridium perfringens type A toxin production in 3 commonly used culture media. Journal of veterinary diagnostic investigation, 19(2), 184-186.
- Fernandez-Miyakawa, M. E., Sayeed, S., Fisher, D. J., Poon, R., Adams, V., Rood, J. I., Uzal, F. A. (2007). Development and application of an oral challenge mouse model for studying Clostridium perfringens type D infection. Infection and immunity, 75(9), 4282-4288.
- Fisher, D. J., Fernandez-Miyakawa, M. E., Sayeed, S., Poon, R., Adams, V., Rood, J. I., . . . McClane, B. A. (2006). Dissecting the contributions of Clostridium perfringens type C toxins to lethality in the mouse intravenous injection model. Infection and immunity, 74(9), 5200-5210.
- Forbes, B., Sahm, D., & Weissfeld, A. (2002). Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology. USA: Mosby: Inc.
- Fox, J. G., Barthold, S., Davisson, M., Newcomer, C. E., Quimby, F. W., & Smith, A. (2006). The mouse in biomedical research: normative biology, husbandry, and models (Vol. 3): Academic Press.
- Fujii, Y., & Sakurai, J. (1989). Contraction of the rat isolated aorta caused by Clostridium perfringens alpha toxin (phospholipase C): evidence for the involvement of arachidonic acid metabolism. British journal of pharmacology, 97(1), 119-124.
- Fujii, Y., Nomura, S., Oshita, Y., & Sakurai, J. (1986). Excitatory effect of Clostridium perfringens alpha toxin on the rat isolated aorta. British journal of pharmacology, 88(3), 531-539.
- Gurjar, A., Hegde, N., Love, B., & Jayarao, B. (2008). Real-time multiplex PCR assay for rapid detection and toxintyping of Clostridium perfringens toxin producing strains in feces of dairy cattle. Molecular and cellular probes, 22(2), 90-95.
- Hale, M. L., & Stiles, B. G. (1999). Detection of Clostridium perfringens alpha toxin using a capture antibody ELISA. Toxicon, 37(3), 471-484.
- Heba, H., & Amer, H. A. (2009). Pathological and bacteriological studies on Clostridium perfringens infection in kidney of cattle, camel and sheep. Egyptain Journal of Comparative Pathology and Clinical Pathology, 22(2), 88-108.
- Heikinheimo, A. (2008). Diagnostics and molecular epidemiology of cpe-positive Clostridium perfringens type A. Doctoral dissertation, University of Helsinki, Faculty of Veterinary Medicine, Department of Food and Environmental Hygiene.
- Holdsworth, R., & Parratt, D. (1996). The potential role of Clostridium perfringens alpha toxin in the pathogenesis of acute pancreatitis. Journal of clinical pathology, 49(6), 500-503.
- Hough, E., Hansen, L. K., Birknes, B., Jynge, K., Hansen, S., Hordvik, A., Derewenda, Z. (1989). High-resolution (1.5 Å) crystal structure of phospholipase C from Bacillus cereus. Nature, 338(6213), 357-360.
- Jousimies-Somer, H., Summanen, P., Citron, D., Baron, E., Wexler, H., & Finegold, S. (2002). Wadsworth-KTL anaerobic bacteriology manual, Star Publishing Company. Belmont, CA.
- Kalender, H., & Ertaş, H. B. (2005). Isolation of Clostridium perfringens from chickens and detection of the alpha toxin gene by polymerase chain reaction (PCR). Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences, 29(3), 847-851.
- Keel, M. K., & Songer, J. (2006). The comparative pathology of Clostridium difficile-associated disease. Veterinary pathology, 43(3), 225-240.
- Lahti, P., Heikinheimo, A., Johansson, T., & Korkeala, H. (2008). Clostridium perfringens type A strains carrying a plasmid-borne enterotoxin gene (genotype IS1151-cpe or IS1470-like-cpe) as a common cause of food poisoning. Journal of Clinical Microbiology, 46(1), 371-373.
- Lebrun, M., Filée, P., Mousset, B., Desmecht, D., Galleni, M., Mainil, J., & Linden, A. (2007). The expression of Clostridium perfringens consensus beta2 toxin is associated with bovine enterotoxaemia syndrome. Veterinary microbiology, 120(1), 151-157.
- Levinson, W., & Jawetz, E. (2010). Medical microbiology and immunology: examination and board review: Appleton & Lange.
- MacFaddin, J. (2000). Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria
- MacFaddin, J. F. (2000). Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. United States: Lippincott Williams & Wilkins; 3rd edition.
- Mainil, J. (2006). Genus Clostridium-Clostridia in medical, veterinary and food microbiology: Diagnosis and typing. Belgique: European Commission.
- Merchant, I., & Packer, R. (1967). Veterinary Bacteriology and Virology. Iowa State College Press, Ames, Iowa.
- Meyers, D. J., & Berk, R. S. (1990). Characterization of phospholipase C from Pseudomonas aeruginosa as a potent inflammatory agent. Infection and immunity, 58(3), 659-666.
- Myers, G. S., Rasko, D. A., Cheung, J. K., Ravel, J., Seshadri, R., DeBoy, R. T., Brinkac, L. M. (2006). Skewed genomic variability in strains of the toxigenic bacterial pathogen, Clostridium perfringens. Genome Research, 16(8), 1031-1040.
- Nagahama, M., Michiue, K., & Sakurai, J. (1996). Membrane-damaging action of Clostridium perfringens alpha-toxin on phospholipid liposomes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1280(1), 120-126.
- Nagahama, M., Mukai, M., Morimitsu, S., Ochi, S., & Sakurai, J. (2002). Role of the C‐domain in the biological activities of Clostridium perfringens alpha‐toxin. Microbiology and immunology, 46(10), 647-655.
- Nagahama, M., Oda, M., Kobayashi, K., Ochi, S., Takagishi, T., Shibutani, M., & Sakurai, J. (2013). A recombinant carboxy‐terminal domain of alpha‐toxin protects mice against Clostridium perfringens. Microbiology and immunology, 57(5), 340-345.
- Naylor, C. E., Jepson, M., Crane, D. T., Titball, R. W., Miller, J., Basak, A. K., & Bolgiano, B. (1999). Characterisation of the calcium-binding C-terminal domain of Clostridium perfringens alpha-toxin. Journal of molecular biology, 294(3), 757-770.
- Oda, M., Terao, Y., Sakurai, J., & Nagahama, M. (2015). Membrane-binding mechanism of Clostridium perfringens alpha-toxin. Toxins, 7(12), 5268-5275.
- Paktinat, M., Khodabandeh, M., Amiri, B. M., & Farahmand, H. (2012). A Simple Method for Purification of Low Levels of Beluga (Huso huso) Vitellogenin. Paper presented at the International Conference on Applied Life Sciences.
- Progar, V. (2016). From MicrobeWiki, the student-edited microbiology resource. Available at: https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Clostridium_perfringens_toxins.
- Rocha, P., Assis, R., Lobato, F., Cardoso, V., & Heneine, L. (2008). Stability and toxicity of Clostridium perfringens type D epsilon prototoxin treated by iodine. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, 60(4), 824-824.
- Sakurai, J., Nagahama, M., & Oda, M. (2004). Clostridium perfringens alpha-toxin: characterization and mode of action. Journal of biochemistry, 136(5), 569-574.
- Sakurai, J., Nagahama, M., & Oda, M. (2004). Clostridium perfringens alpha-toxin: characterization and mode of action. Journal of biochemistry, 136(5), 569-574.
- Shimizu, T., Ohtani, K., Hirakawa, H., Ohshima, K., Yamashita, A., Shiba, T., . . . Hayashi, H. (2002). Complete genome sequence of Clostridium perfringens, an anaerobic flesh-eater. Proceedings of the National Academy of Sciences, 99(2), 996-1001.
- Shreya, D., Uppalapati, S. R., Kingston, J. J., Sripathy, M. H., & Batra, H. V. (2015). Immunization with recombinant bivalent chimera r-Cpae confers protection against alpha toxin and enterotoxin of Clostridium perfringens type A in murine model. Molecular immunology, 65(1), 51-57.
- Smedley, J. G., & McClane, B. A. (2004). Fine mapping of the N-terminal cytotoxicity region of Clostridium perfringens enterotoxin by site-directed mutagenesis. Infection and immunity, 72(12), 6914-6923.
- Souza, A., Reis, J., Assis, R., Horta, C., Siqueira, F., Facchin, S., Silva, R. (2010). Molecular cloning and expression of epsilon toxin from Clostridium perfringens type D and tests of animal immunization. Genet Mol Res, 9(1), 266-276.
- Souza, A., Reis, J., Assis, R., Horta, C., Siqueira, F., Facchin, S., . . . Silva, R. (2010). Molecular cloning and expression of epsilon toxin from Clostridium perfringens type D and tests of animal immunization. Genet Mol Res, 9(1), 266-276.
- Timoney, J. F., Gillespie, J. H., Scott, F. W., & Barlough, J. E. (1988). Hagan and Bruner’s microbiology and infectious diseases of domestic animals.(Ed. 8). UAS: Cornell University Press.
- Titball, R. W. (1993). Bacterial phospholipases C. Microbiological reviews, 57(2), 347-366.
- Titball, R. W., Fearn, A. M., & Williamson, E. D. (1993). Biochemical and immunological properties of the C-terminal domain of the alpha-toxin of Clostridium perfringens. FEMS microbiology letters, 110(1), 45-50.
- Williamson, E., & Titball, R. (1993). A genetically engineered vaccine against the alpha-toxin of Clostridium perfringens protects mice against experimental gas gangrene. Vaccine, 11(12), 1253-1258.
- Yoo, H. S., Lee, S. U., Park, K. Y., & Park, Y. H. (1997). Molecular typing and epidemiological survey of prevalence of Clostridium perfringens types by multiplex PCR. Journal of Clinical Microbiology, 35(1), 228-232.
- Zerbini, L., & Ossiprandi, M. (2009). Molecular typing of Clostridium perfringens strains isolated from dogs by toxin gene amplification. Annali della Facoltà di Medicina Veterinaria, Università di Parma, 29, 115-128.